生物膜是由附着于惰性或者活性固体资料名义的微生物跟由微生物自身分泌的胞外聚合物所形成的高度结构化微生物群落.它的存在可引起一系列的环境问题, 如膜沾染、管道堵塞、金属名义腐化跟消毒效力降落等.目前对其把持多采取杀菌剂、抗菌剂或其它大分子抑菌剂.但这些物质的开释无疑带来了新的环境危险, 长期利用抗生素或者杀菌剂还会导致细菌的抗药性增加, 耐药细菌蔓延.
利用化学信号小分子物质通过克制微生物活性, 调节生物膜的发展进程是目前生物膜范畴的研究热点.双胺是某些微生物自身产生的可能引起一些生物膜瓦解的信号分子, 探讨这种小分子物质的生物膜调控作用对开发新兴生物膜把持技巧存在重要意思.目前, 双胺对微生物附着的克制研究较少且多集中于纯菌生物膜, 对混淆菌落生物膜的克制研究鲜有报道.实际环境中的生物膜多由混淆菌群组成, 因此有必要研究双胺对混淆菌落生物膜克制及解聚效应.本研究将以双胺为目标物质, 考察这种小分子物质对混淆菌落生物膜形成克制及瓦解效应机制, 并进一步对其减缓膜名义生物沾染的可行性进行探讨.该研究对树破基于小分子物质的生物膜克制及膜名义生物沾染把持方法存在实际价值与实际领导意思.
2 资料与方法2.1 化学试剂跟微生物
双胺购自美国Sigma-Aldrich公司, 纯度为99%.其余化学试剂购于梦怡美生物科技有限公司.
混淆菌落来源于清河污水处理厂的活性污泥, 经过上海美吉生物医药科技有限公司通过MiSeq体系剖析组成重要包含丛毛单胞菌属、孢鱼菌科、肠杆菌科、梭状芽孢杆菌、鞘脂单胞菌属、假单胞菌属、固氮螺菌属、寡养单胞菌跟铁杆菌属.活性污泥首先用磷酸盐缓冲溶液冲刷3遍以去除污泥溶液中的EPS及有机物, 而后将活性污泥重悬于合成废水中用于制备混淆菌菌悬液.合成废水包含：COD 825;NH4Cl 192;KH2PO4 35.1;NaCl 100;MgSO4 100;CaCl2 10;pH=6.5~7.5.
2.2 双胺对混淆菌群生物膜形成影响研究
将含有不同浓度双胺的菌悬液加入到聚苯乙烯的12孔板中, 每孔4 mL, 双胺终浓度分辨为0、2.62、6.55、13.10、26.20、65.50或131 mg·L-1, 每个浓度设置6个平行样以确保实验的正确性.将加完样品的12孔板置于30 ℃恒温培养箱中分辨静止培养12 h跟24 h.培养实现后附着的生物膜量利用结晶紫染色法绝对定量.本研究以活性污泥作为生物膜形成的混淆菌来源, 随着生物膜的形成跟发展, 其群落结构可能会与活性污泥有一些差别, 但本研究重点不是关注其群落结构演变进程, 而是以生物膜情势负载到基底资料名义生物量的变更, 并以其来评估生物膜形成克制效应.
2.3 不同基底层上双胺对混淆菌群附着影响
克制剂对微生物附着特点的影响跟附着基底资料名义特点密切相干, 所以本研究进一步考察了双胺对微生物在不同材质基底层名义的附着影响.分辨抉择存在不同亲疏水性特点的聚苯乙烯、玻璃片跟聚甲基丙烯酸甲酯3种资料为附着界面, 3种名义接触角分辨为93.4°、22.0°跟81.9°.分辨将20 mm× 20 mm玻璃片或聚甲基丙烯酸甲酯片置于6孔板中进行附着实验, 每个孔板中加入6 mL污泥悬液, 再分辨加入双胺终浓度为0或131 mg·L-1.污泥悬液、基质浓度及操作前提跟上述的附着实验一致.培养24 h后, 将载玻片烘干, 染色并用Olympus相机进行拍照记录.
2.4 双胺对膜沾染缓解效应研究
将双胺投加到溶液通过跟悬浮微生物作用之后, 微生物在膜名义的附着实验分辨以静态附着跟动态逝世端过滤情势考察.静态实验如下：将直径为3.5 cm的膜片置于6孔培养板, 加入10 mL混淆菌液, 同时加入双胺使其终浓度分辨为0或131 mg·L-1, 30 ℃恒温培养箱中静止培养24 h, 取出膜片放在15 mL PBS中超声使附着的微生物完全脱落伍在旋涡混淆器中疾速混淆15 s, 测定细菌OD600值.动态过滤采取恒流过滤模式, 利用一台蠕动泵将储水容器中混淆菌液通过管道压入膜组件, 电子天平收集溶液的品质数据, 当膜名义造成一定堵塞之后, 膜压增加, 压力表读数回升.通过压力表读数可间接评估膜沾染发展状况.
2.5 双胺对混淆菌群生物膜瓦解影响研究
为了考察双胺对生物膜的瓦解机能, 需预先培摄生物膜.而后将载玻片拿出洗掉未附着的微生物.而后放置于含有131 mg·L-1双胺的PBS溶液中, 另外的载玻片放入只含有PBS的溶液中作为对比, 30 ℃分辨静置6、8、10或12 h后, 将载玻片拿出洗掉悬浮的微生物, 残余生物量采取如上结晶紫染色法进行绝对定量.
2.6 双胺对悬浮微生物EPS散布影响研究
为了探讨双胺对生物膜形成克制机理, 本研究进一步对悬浮混淆菌群微生物的EPS进行考察.具体操作步骤如下：将含有一定浓度的污泥悬液跟基质置于50 mL离心管中, 同时加入双胺使其终极浓度分辨为0、131 mg·mL-1, 30 ℃放置一定时光, 测定EPS含量变更, 同时测定悬浮液的OD600变更.EPS的提取参考Xuan等的方法, 蛋白测定采取的Lowry法, 多糖的测定采取的是硫酸-苯酚比色法;eDNA的测定参考Allesen-Holm等的方法.
3 结果与探讨3.1 双对混淆菌群生物膜形成影响
不同浓度双胺对混淆菌群微生物附着特点的影响结果如所示.微生物经2.62~131 mg·L-1双胺处理12 h附着量降落了5.61%~67.93%, 处理24 h附着量降落了4.60%~74.61%.可见在选定的两个时光段对微生物附着的克制造用均随着双胺浓度升高而加强.
不同浓度双胺对混淆菌落生物膜形成影响
3.2 不同基底层上双胺对微生物附着影响
微生物附着到载体名义是生物膜形成的第一步, 可能通过特异性或者非特异性的细菌-名义彼此作用产生.一些名义特点会影响微生物的附着, 且一些克制剂对微生物附着克制造用也会受到名义特点的影响.因此, 本研究对不同基底层上双胺对微生物附着影响特点进行考察.双胺存在的情况下, 附着到基底资料的生物量经结晶紫染色记录, 如所示.结果显示无论是在疏水性的聚苯乙烯名义还是亲水性的聚甲基丙烯酸甲酯跟玻璃名义, 双胺对微生物的附着均有很好地克制造用.说明这种物质可能普遍利用于不同材质资料名义生物膜的把持.
不同基底层名义双胺对微生物附着影响
3.3 双胺对膜沾染缓解效应研究
另外, 为了进一步探讨双胺把持膜名义生物沾染的可能性, 将双胺投加到溶液通过跟悬浮微生物作用之后, 考察微生物在膜名义的附着状况, 分辨以静态附着跟动态过滤情势考察.静态情势培养前提下, 微生物经过不同浓度的双胺作用后在聚酰胺膜名义的附着量如所示.结果显示, 微生物经过双胺处理在膜名义的附着量明显降落, 而且双胺浓度越高, 附着量越少.例如, 经过26.2、65.5及131.0 mg·L-1双胺处理后, 微生物在膜名义附着量分辨降落了18.38%、31.03%跟69.15%.双胺明显克制了微生物在膜名义的附着, 而且这种克制后果跟双胺浓度成正相干.此结果也在SEM中得到证明, 对比组膜名义形成的微生物群落比较致密, 生物膜连成片, 而实验组膜名义附着的微生物相称稀少, 有大量的空白区域, 实验组膜名义附着的生物量要明显少于对比组膜名义附着的微生物量.
双胺对混淆菌落微生物在聚酰胺膜名义的附着影响
对生物膜动态过滤培养进程, 膜过滤进程中膜压随过滤液品质及时光变更如所示.由图可能看出, 当过滤分量为359.71 g, 过滤时光170 min时, 对比组膜孔产生了一定水平的堵塞, 此时膜压为10 kPa, 但实验组中的膜压仍然为0, 表明膜孔径并不像对比组膜堵塞重大;当过滤液品质为628.55 g, 过滤时光为300 min时, 实验组中的膜压力开端回升, 膜压为12.5 kPa, 约为过滤时光175 min时的对比组膜压, 而此时对比组中的膜压已经为50 kPa.这表明双胺可减缓膜过滤进程中膜孔堵塞速度, 降落膜压, 缓解由微生物引起的膜沾染问题.具体接洽污水宝或参见http://www.dowater.com更多相干技巧文档
膜过滤进程膜压随过滤品质跟过滤时光变更图
3.4 双胺对混淆菌群生物膜瓦解影响
一些传统的物理化学方法, 如冲刷、消毒剂及紫外线消毒等常被用作生物膜去除, 但因为生物膜中细菌受EPS的维护作用使其对这些通例方法存在一定抗性, 即便高浓度的杀菌剂也很难将生物膜去除.例如, 500 mg·L-1的通例剥离剂也难以剥离成熟的生物膜, 紫外线对生物膜中微生物杀灭才干明显弱于对悬浮微生物的杀灭作用.本研究进一步对小分子物质双胺是否引起成熟生物膜瓦解进行探讨.131.0 mg·L-1双胺对预培养12 h的生物膜瓦解后果如所示.由图得出, 双胺处理生物膜6~12 h后, 生物膜量绝对对比组降落了3.87%~23.59%, 由此可能说明双胺对生物膜瓦解有一定的增进作用.这对把持生物膜, 降落微生物保险危险存在重要的意思.
双胺对成熟生物膜的瓦解作用
3.5 双胺对微生物EPS分泌的影响
为了进一步摸索双胺对微生物的作用机制, 本研究进一步考察了双胺对微生物成长及其EPS的影响.结果如所示, 131 mg·L-1双胺对微生物12 h成长量的克制率为0.36%±0.54%, 不克制微生物成长;对比组中胞外蛋白、多糖跟eDNA的含量分辨是 mg·g-1 MLVS
S、 mg·g-1 MLVSS跟 μg·g-1 MLVSS, 经过双胺处理之后, 胞外多糖跟eDNA均有降落, 分辨为 mg·g-1 MLVSS, μg·g-1 MLVSS, 降落了39.37%±2.68%跟70.05%±2.93%, 而胞外蛋白含量多少乎不变更, 均坚持在8.02~8.98 mg·g-1 MLVSS.本课题组进一步通过激光共聚焦察看及定量盘算显示双胺对生物膜处理后使多糖减少了53%.由此可能推断双胺对微生物附着及生物膜形成的克制造用并不是通过杀菌产生, 对微生物EPS中胞外多糖跟eDNA分泌有一定的克制造用, 但对胞外蛋白不影响.
双胺对微生物成长及EPS产量的影响
据报道, 双胺结构中含有的氨基可能直接跟一些带负电荷的基团或者是胞外多糖中一些带有极性基团的糖类彼此作用, 这可能是其引起二者浓度降落的重要起因.家喻户晓, EPS对微生物附着及其生物膜形成起着至关重要的作用, 它促使微生物在生物跟非生物名义的初始附着.将EPS完全去除当前, 微生物的附着机能明显降落.胞外多糖是生物膜形成的引诱因子, 可使名义预处理化附着更轻易产生, 甚至可能作为细菌碳源;eDNA对微生物在亲水性跟疏水性名义的附着都起着重要的作用, 它通过多种方法调控生物膜的发展进程, 如为其余细菌供给基质、它是生物膜结构的重要成分、可增进基因物质的交换及调控结合性摄取体系等.另外, EPS中的蛋白组大多为带正电荷的疏水性物质、多糖为带负电荷的亲水性物质及eDNA为带负电荷的疏水性物质, 三者之间的彼此作用坚持了细菌的名义特点, 当这三者组成产生变更时会造成细菌名义特点的变更, 而细菌名义特点跟微生物的附着密切相干.所以本研究中双胺通过克制微生物中EPS某些成分的特点或者分泌, 进而影响微生物附着跟生物膜形成, 并且导致一小局部的生物膜可能从EPS的包裹中开释出来瓦解为悬浮态细菌, 即引起生物膜瓦解.已有一些报道也发明当EPS中蛋白、多糖跟eDNA浓度降落时, 微生物附着量相应降落.
4 论断
1) 双胺能有效克制混淆菌群微生物附着跟生物膜形成, 随着浓度的升高克制造用加强, 且其克制后果较为牢固, 克制率不会随着时光延长而降落.
2) 双胺对成熟生物膜瓦解有一定的增进作用.这对把持生物膜, 降落微生物保险危险存在重要的意思.
3) 双胺在生物膜形成有效克制浓度范畴内并错误于微生物成长产生明显作用, 因此不是通过杀菌方法克制生物膜形成, 而是通过克制微生物中EPS含量, 可能避免传统杀菌剂产生的抗药性问题, 因此为生物膜克制供给了新方法.
4) 双胺可减缓膜过滤进程中膜孔堵塞速度, 降落膜压, 缓解由微生物引起的膜沾染问题, 这对环境中膜沾染把持存在潜在的领导意思.
